Методе инокулације биљака

Пре него што наставите са инокулацијом биљака, треба их припремити. Требају бити без инфекција, очигледно здравих. За то се експерименталне биљке најбоље узгајају из здравих семенки у пластеницима или узгајајућој кући у саксијама (цветним саксијама) испуњеним тлом без заразе. Сјеме прије сјетве дезинфицира се конвенционалним средствима за облагање, а тло се аутоклавира под притиском 1-2 атм.

При расту биљке се залијевају без влажења површине лишћа и стабљика (вода се излива директно на тло или кроз посебно убачене цеви). Ако је могуће, искључите вањску или случајну инфекцију коју преносе инсекти или кроз ваздух.

Ако се експерименталне биљке у експерименту са пластеницима не могу добити из семена, онда се биљке које расту у дивљини узимају и пресађују у саксије, након чега се чувају у стакленику најмање један (пожељно 1,5-2,0) период инкубације болести. изазвана гљивом која се проучава. Практично за то је 7-10 дана сасвим довољно.

Код инокулације биљака гљивама у пољу потребно је претходно изолирати означене надземне органе из околине остакљеним дрвеним оквиром, папирним поклопцима, пластичним кесама, стаклом за шарпу или чашама на лампи - последњи су везани колцима, а горња и доња рупа су затворене памучним тампоном . Таква прелиминарна изолација током 1-2 инкубационог периода је неопходна да би се потврдило заиста здраво стање експерименталних биљних органа. Штавише, у свим случајевима настоје да осигурају да се изоловане биљке или њихови органи нормално развијају, да нису етиолирани, хлоротични, пропадају итд..

Могуће је вршити експерименте на одсеченим деловима биљака умоченим у воду, у хранљивом раствору, као и на одвојеним листовима смештеним у раствору бензимидазола.

Методе инокулације биљака су прилично разнолике и зависе од биологије гљиве и улоге инфекције у патогенези болести, као и од циљева студије (проверавање патогености сојева, процена отпорности сорти и сл.). Размотрите бројне технике инокулације које су прилично добро тестиране и могу се препоручити у практичном раду..

Инокулирање биљака може се извршити и патогеном на узгајаном вештачком хранљивом медијуму, као и природном популацијом гљивичних спора. У зависности од задатка, користе се различити инокули - мицелијум, споре прикупљене од једне сорте биљке домаћина или представљају географску популацију итд..

Приликом одабира методе инокулације узима се у обзир продуктивност рада, јер се често вреднују хиљаде сорти. Методе и време вештачке инфекције су што ближи природним. У свим случајевима се стварају услови који су оптимални за раст патогена (температура, влажност). Број инокулираних биљака треба да буде најмање 10 уз обавезну контролу.

Бројне болести (прашњава смрека пшенице и јечма, раж риже, хелминтоспориоза јечма и зоби, жута хрђа пшенице итд.) Карактеришу се продором инфекције кроз цвеће и јајнике. У том се случају инокулација врши примјеном сувих спорова или суспензије гљивичних спорова на цвијеће и јајнике. На пример, М. К. Хокхриаков (1969) указује да је најједноставнија метода инокулације пшенице и јечма смрадом прашине прскање кламидоспора узрочника болести током цветања житарица из газиних кесица или резање погођених ушију.

В. И. Кривченко (1963) модификовао је вакум методу инокулације пшенице патогеном смутом користећи посебан уређај који се састоји од цилиндра у који су убачене уши на виновој лози. Овај цилиндар има две излазне цеви, од којих је једна повезана на пумпе, а друга служи за довод ваздуха. Одоздо се помоћу посебног чепа и црева за вакум стезање испоручује суспензија спора (0,2 г спора на 0,5 л воде). Суштина методе је да, док избацивање из цилиндра из ушију ваздуха, вода с спорама улази тамо. Након довода ваздуха, суспензија се враћа у посуду. За добијање поузданих података довољно је заразити 6-10 ушију једне сорте, а када се оцењују породице и линије хибрида, најмање три уши.

Е. Е. Гесхеле (1964) дели методе инокулације уљних мрља у две групе: појединачна инфекција цвећа и цело ухо. У првом случају, један горњи и два доња шиљка сече се маказама, а средњи цветови се уклањају пинцетом. Након тога се сваки цвет отвори и споре се уносе пинцетом. Овај метод има бројне модификације. Конкретно, можете заразити цвет посебном пипетом с крушком. У другом случају, материјал који садржи инфективни застој се наноси на здраво ухо, након што су претходно извршени урези на нивоу зубног зуба..

Цветови јечма инокулирају се конидијама узрочника пругасте хелминтоспоријазе помоћу вакум уређаја у периоду када шиљак још није напустио цев, већ само врхови осица.

Цветови воћних култура заражени су гљивицама рода Монилиниа, наношењем сувих конидија на навлаженим крајем игле на стихију штетника. Затим се цветови прскају водом из спреј-боце и на њих се ставља изолатор од газе натопљен водом, који је дан прекривен пластичним филмом. У јужним пределима, поред тога, инокулиране цвастиће нејасне - раде исто када су заражене ушима.

Инокулиране воћне гране су изоловане на исти начин као и цвеће. Ако се експерименти спроводе на одсеченим изданцима, онда се након примене инфекције на лишће, изданци смештају у влажне коморе од стаклених чепова обложених влажним филтрирним папиром изнутра током 24 сата на оптималној температури.

Када се инфективни агенси примене на лишће, стабљике и друге органе биљака, по правилу се користи суспензија спорова патогена (конидија). Воштани премаз на површини листа отежава продирање гљивица, па се уклања прије инокулације пуштајући лист да прође између влажних прстију. Материјал који садржи инфекцију се по правилу наноси на доњу страну листа у облику капи водене суспензије из спреја или трљати инокулум по листу скалпелом. Понекад се користе суве споре које се стерилном четкицом наносе на навлажене листове..

За вештачку инфекцију лишћа директно на биљкама, могу се користити влажне коморе малог обима у облику целофанских чашица (пречника 20 мм) притиснутих дуж ивица еластичном опругом (метода М. С. Дунина).

Инокулиране биљке током одређеног времена (12, 24, 48 сати) смештају се у влажну комору да се обезбеди потпунија инфекција. На терену се то постиже наношењем суспензије спора у облачним данима или у вечерњим сатима, посебно ако се очекује роса.

Инфективни материјал хрђе од житарица обично се припрема два сата пре наношења на биљке. Да бисте то учинили, узмите 200-300 погођених листова, потопите их у воду (0,5-1 л) и исперете уредоспоре с њих. Око 150 литара суспензије се потроши на 150-200 м2 сјетве (Л.Ф. Русаков, 1926). У стационарним условима, инокула се припрема унапред у пластеницима или на посебним усјевима. За инфекцију парцела - дистрибутера рђе, треба узети 5 мг уредоспора по 1 м2, прскајући их заједно с талком у омјеру 1:30 или 1: 100. Уз континуирану инокулацију по 1 м2, у случају накнадног облагања биљака филмом и 20 мг без влажне коморе, троши се 2 мг одрживих уредоспора (К. М. Степанов, 1966).

Вештачка инфекција биљака базидиоспорама рђе (на пример, линеарна или смеђа) врши се у влажној комори. Делови биљака са развијеним телетоспорама узимају се и постављају изнад инокулиране биљке тако да, како сазревају, базидиоспоре падају на њену површину.

Постоје извештаји о могућности инокулације патогена пирукулариозе и прашкасте пшенице појединачним лишћем житарица смештених у влажним коморама, као и малим круговима живих листова (пречника 12-14 мм) дувана са гљивом. Пероноспора табацинали. Истовремено се постављају у Петријеве посуде чији је дно обложено са три слоја филтрираног папира засићеног без вишка храњивим раствором следећег састава (у г на 100 мл воде): калијум и натријум тартарат (КОСО - ЦХОН - ЦХОН - ЦООНа) - 0,5- К2НРО4 - 0,1 - КНО3 - 2,0 - Цо (Н03) 2 - 0,06 - КЦл - 0,03 - МнО4 - 0,001 и Мг04 - 0,5 (Исард, 1960).

Када се, на пример, проучавају облигати паразита дрвених врста, користе се посебне методе. При раду са вокалуметицким гљивицама које изазивају деформацију плодова и грана, изданци са знаковима оштецења исецених од болесних стабала постављају се у посуде са водом како би се затворили аскоспоре, који су прекривени широким стакленим поклопцем. Испод ивице хаубе постављају се заптивке висине око 10 цм за приступ ваздуху. Након 1-2 дана, на захваћеним органима појављује се марсупијална спорпорација гљивице. Формиране аскоспоре се стерилним скалпелом преносе у експерименталне здраве биљке, на јајнике или пруге које почињу да се развијају. У исто време, вага се присилно открива. Употребљавају се и друге посебне технике засноване на биологији патогена, циљевима експеримента и могућности да инфекција продире под одређеним условима (Гесхеле, 1971)..

При раду са узрочником грашка аскохитоза, према методологији Државне комисије за испитивање сорти, инокулум се добија у епруветама на косом агару. Из једне епрувете гљивичне културе припрема се суспензија мућкањем у 1 литру воде. Штавише, у једној капи течности у просеку треба да се налази око 40-50 конидија патогена. На 1 м2 сјетве се потроши 2 л суспензије.

Сјеме се може цијепити суво или влажно. Загађење семена се практикује током проучавања тврдог пшенице. Истовремено се потроши 1 кг семенки на 1 кг спора, зависно од очекиваних временских услова током сетве и наредних дана. Када време није повољно за просипање мрље, оптерећење заразе се повећава. -10 ° Ц. Ако треба испитати мале семенке, тада се опрашују прекомерном количином спора и пролазе кроз сито. Да би се створило потребно заразно оптерећење, семенке јечма и зоби треба уклонити из филмова, а Е. Е. Гхехеле (1964) препоручује уклањање само оног дела филма који покрива ембрион. У осталим случајевима, семе се расипа танким слојем на густој површини, прска се суспензијом спора, чува у влажној комори. Сјеме јечма и зоби се такође успјешно инокулира са смутом урањањем у суспензију спора. За 100 г семенки припрема се 100 цм3 суспензије од 4-10 г спора. Сјеменке се чувају у суспензији 15 минута, темељно мијешајући смјесу три пута. Затим се семе стави у газе, вреће се оставе водом и инкубирају током 24 сата на 20 ° Ц. Након сушења семе се посеју.

Сјеменке овса, контаминиране кантама, са уклоњеним филмовима клијају у кутије са влагом од 25 ° Ц и температуром од 20 ° С. Након избијања трансплантирају се у поље. Иста метода Е. Е. Гесхеле (1964) препоручује употребу у случају вештачке инфекције јечма смутом и патогеном пругасте хелминтоспориозе.

При инокулирању (схтамбов) воћака на кору након 1-1,5 цм, постављају се два попречна резова, између којих се кора пресече у средини у уздужном смеру, савијајући њене листове, правећи неколико плитких резова дрвета и уводећи културу испитиваног патогена заједно са комадом агарског медијума. Затим се кортикални преломи затварају, а место инфекције прекрива се пластичним омотачем или пергаментом, причвршћујући ивице врпцом или траком. Када користите папир, под прекривач се ставља навлажени комад памучне вуне..

У случају инфекције скелетних грана патогенима који се могу развити само у претходно ослабљеним ткивима, потоњи се катеризују у близини места инокулације.

У случају вештачке инфекције дрвећа врста паразитима (гљиве рода) Цитоспора и др.) експерименти се најбоље изводе у лабораторијским условима на одсеченим изданцима. Да би се то урадило, из тестне сорте сече се лигнифицирани изданци дуги 150 мм и дебљине око 10 мм у количини од 20 ком. (10 комада за искуство и контролу). Затим се, на удаљености од 50 мм од врха изданака, направи рез до дубине од 5 мм - након површинске стерилизације у њега се ставља агар медијум са гљивичним мицелијем. Место инокулације је затегнуто пластичним омотачем, који је на ивицама фиксиран навојима или изолацијском траком. На полеђини фолије, памук се ставља под филм, који се по потреби повремено навлажи ињекционим штрцаљком кроз филм.

Резнице се постављају у чаше са водом или са претходно калцинираним влажним песком. Будући да су у води или песку, резнице почињу да недостају минерали у земљи, њихове виталне функције слабе и умиру. Овај процес траје дуго, што вам омогућава да одредите временски период резнице болести различитог степена слабљења, дакле, патогене способности гљивица и отпорност биљака.

Заражени изданци се упоређују са контролом користећи ординални критеријум Кс, обично у време одумирања 2/3 резница најосетљивије сорте. У случају када ће појачано формирање калуса проћи по ивицама ране, рана се чисти и врши се секундарна инокулација без прекида експеримента.

Саднице са стабала могу се инокулирати уношењем инфекције у стабљицу медицинском шприцом. Можете заразити почетак у коренима директно у земљи, оштетивши их металном шипком (споре патогена се уносе у резултирајућу рану).

Инокулација плодова и корјенастих култура врши се наношењем суспензије спорова патогена на њихову стерилну површину. У овом случају, такође можете да користите суве споре, пробушивши или зарезујући плод на кожи, или убризгавате водену суспензију спора (1 кап) са шприцом испод коже. Понекад се инфекција унесе у дубок рез коренетске плодове, затим убацујући исечени део на првобитно место.

Најчешће се инокулум наноси на тло да би се створила инфективна позадина без оштећења коријенских система - гљива се најпре размножава на посебним медијумима.

За дугогодишњи рад са широким спектром биљних врста и сорти користе се разне заразне позадине. Могу бити природне и вештачке, а могу се разликовати и у степену манифестације болести (слабе, јаке).

На пример, када стварају заразну позадину у тлу, на пример, узрочници памучне вене, чисте културе гљива прво се узгајају у тиквицама са стерилним семеном овса (100 зрна на 100 цм3 воде). Затим се културе размножавају у боцама са средством истог састава. На сваких 100 м2 површине примењује се 3-4 кг културе (друга метода је описана у даљем тексту).

Уношење гљивичних култура у тло такође се користи када се ради са патогенима вена (вене) патлиџана и бибера - склеротија патогена користи се током пупољавања биљака са прелиминарним оштећењем корена.

Изводи се инокулација садница јечма и пшенице узрочницима хелминтоспориозе, фусаријума, опиоболеза и других патогена, увођењем културе гљива у семенске редове заједно са семеном. Користе се чисте културе гљива које се узгајају на житарицама или агарима (0,5 скроб, 0,02 КХ2П04, 0,02 Ца (Н03) 2 0,02 пептона и 2 агар агар). Такође се користи и заражени део сламе. Редови током сјетве прекривени су зараженом сламом у количини од 20 згњечених биљака помијешаних са 1 кг хумуса на 25 м врсте сјетве (Е. Е. Гесхеле, 1964).

Приликом стварања заразне позадине патогена сњежне плијесни смјеса сојева (Фусариум нивале, Типхула инцарната итд.), које се претходно узгајају на закисељеном агару кромпира и затим размножавају на стерилном зоби. Пре уношења културе гљива у тло, они се помешају са земљом у једнаким количинама и равномерно се распоређују по површини парцеле. Инфекција се уноси у тло у јесен брзином 200 г културе овса на 1 м2. Контаминирано тло је одозго прекривено слојем земље величине 1-1,5 цм. Прве године на инфективној позадини врши се извиђачка сјетва. Ако је истовремено излучивање биљке из патогена једнолично, онда се следеће године парцела користи за експерименте (В. К. Неофитова, Н. А. Новик, 1969).

Ланено ланено рђа заразна позадина (Мелампсора лини) створити уз помоћ сламе за лич, на коју утиче узрочник болести (мешавина сорти). Таква слама (стабљика) полаже се у јесен под снег. У пролеће су захваћене стабљике задржане у води 2-3 сата и проверава се клијање телетоспора, клијајући их на 50-100 сегмената стабљика у влажној комори. Проклијале споре броје се 48 сати након што су смештене у влажну комору.

Прва метода је применљива у проучавању биологије патогена и инокулације појединих биљака, друга - у теренској процени сорти.

Када се створи заразна (провокативна) позадина за узрочника вертикалинског витка памука на парцели у првој години, биљне крхотине погођене гљивицом (гуза-паи) мирисају и обилно се залијевају. Следеће године обавља се изравнавајућа сетва сорте памука подложне овој болести, након бербе погођени биљни остаци поново миришу. Сјетва за изједначавање је такођер потребна како би се провјерила поузданост провокативне позадине. Тек након такве верификације може се сматрати да је припремљена за тестирање сорти.

Инфекција лана антрацнозом (Цолототрицхум лини) спроводи се уношењем инфекције у земљу и прскањем садница суспензијом спора. Као заразни материјал користе се погођена ланена слама и саднице, као и чиста култура патогена која се узгаја на овсу и агару. Да би се заразио тло, у подлогу се стављају чиста култура гљива, болесне саднице и ланена слама. Вегетативне биљке инокулирају се суспензијом спора у фази садње (Т. В. Крилова, Иу. Т. Карпунина, 1969).

Заражено белим трулежима сунцокрета (Склеротиниа либертиана) примените методу код које се истовремено са семенкама помоћу ручне садне машине у свако гнездо уводе 2-3 мала склеротија узрочника узрочника болести. Наведена метода омогућава вам да добијете знакове болести на базалном делу стабљике (А. И. Лукасхевицх, 1969).

Повећање залиха праха сунцокрета (Пласмопара хелиантхи) се изводе на следећи начин. Прво се припрема суспензија за зооспоре, за коју су захваћени листови и слој влажног филтрирног папира постављени у влажне коморе. Влажне коморе се чувају на температури од 16-20 ° Ц. Зреле конидије уклањају се са површине листова бритвицом или мокрим тампоном и припрема се суспензија. Инокулација биљака врши се тако што се суспензија лепљивих семенки држи у суспензији 5-8 сати на температури 17-19 ° Ц. Затим се саднице сунцокрета садњују у кутије величине 50 × 40 × 15 цм, пластеницима или отвореном тлу. У кутије и лежаљке постављају се биљке према шеми: између редова 10-15, у ред 2-3 цм - у отворено тло - између редова 45-60 и у ред 3-5 цм.

Узрочник склеротичне детелине узгаја се из склеротије на кришке кромпира у влажној комори. Затим се кришке са развијеним мицелијем паразита ставе испод биљака у коријенски врат.

На сличан начин повећава се број инфекција у тлу вишеструким уношењем биљних остатака заражених патогенима плијесни сунцокрета, коријена и коријена трулежи пшенице и јечма, кобилице, купуса, аскохитозе грашка итд..

Патогени у тлу (гљивице код порођаја) Вертициллиум, Фусариум итд.) Воће и бобице воћа унапред се размножавају у чистим културама на хранљивом медијуму. Обично се зрно житарица користи као храњива супстрат, која се улива у тиквице (отприлике у односу 1: 1) и стерилисе у аутоклаву под притиском од 1 атм. Затим се инфекција одговарајуће гљивице унесе у тиквице са зрном и инкубира 10-15 дана уз периодично мућкање да се меша супстрат. У исто време, семе голих житарица (пшеница, раж, махунарке) помешају се са пљеском или ситно сецканом сламом да се избегне стварање кашастог маса..

Стопе примене такве културе гљива у тлу варирају у зависности од врсте патогена и биљне сорте. Као подршку можете узети да се 3 кг културе наноси на 120 м2 засада јагодичастог воћа или 1,5-2 кг по хранилишту једног стабла (у зависности од шеме садње).

Стога су горње методе инокулације биљака веома разнолике, уз одређене промене које су применљиве на рад са готово свим фитопатогеним гљивама на широком спектру пољопривредних биљака..