Изолација фитопатогених гљива у чисте културе

Као што је истакла Н. А. Наумов (1937), скуп метода за изоловање и гајење гљивица варира у широком распону у зависности од сврхе студије. Међутим, концепт експеримената се уклапа у један систем. Пре добијања проучаване гљивице у чистој култури, неопходно је имати споре носеће ткиво или мицелијум, без инфекције епифитном микрофлором, која понекад искриви слику, усложњава идентификацију и изоловање погођених ткива..

Једна од најједноставнијих метода за добијање мицелијума или органа за спорацију (укључујући бројне обвезне паразите) је употреба тзв. мокре коморе. Обично се користи за њихову производњу. петријеве посуде или Кокха. Дно шоље и унутрашња површина поклопца обложени су круговима филтрирајућег папира одговарајућег пречника, стерилисани на температури од 110 ° Ц током два сата и навлажени стерилном водом. Мали делови испитиваних ткива у количини од 3-10 узорака након површинске стерилизације, постављају се на дно чаша директно на филтер папир равномерно по његовој површини..

Површинска стерилизација делова оболелих ткива може се извести пламеном горионика за алкохол (пламен), млазом воде или посебним хемикалијама. Метода површинске стерилизације природног супстрата погодна је за дрво, корење, семење или плодове. Што је предмет стерилнији, то је темељније и дуже могуће загревати без страха за одрживост мицелија у ткивима..

Понекад је потребно изоловати патогену гљивицу од полу-разграђеног материјала или блатних делова биљке (перитерапија краста на опалом лишћу итд.). У том се случају тест предмет ставља на ситно сито и неколико сати испире под текућом водом.

Затим се материјал узет за истраживање додатно очисти и дезинфикује са површине потапањем у једну од следећих супстанци: 96- или 50. алкохола у трајању од 2-3 минута - раствор живог хлорида (0,1-ог) са излагањем од неколико секунди до три минуте. 0,5-1,0-раствор раствора калијум-перманганата (до 20 мин) - прочишћени раствор за бељење (прва) - 0,1-1,0-раствор бром-воде (неколико секунди) или у растворима других дезинфекцијских средстава након чега следи прање у стерилној води. У ту сврху се може користити формалински раствор 1: 300, после чега испуштање паре предмета у посуди 30 минута до 2 сата.

Студије гљивица које се развијају у влажним коморама требало би да се изводе директно у чашама, на малом увећању микроскопа у пренесеној или рефлексној светлости..

Након појаве спорулације или знакова развоја мицелија, субкултура се на агарном хранљивом медијуму директно у епрувету за коси агар или претходно на агар медијуму проливеном у Петријеве посуде. Обавезни паразити узгајају се на живим биљкама или у посебним окружењима.

За даљи рад, врло је важно да се култура прочисти. То се постиже ожичењем шипки, разблаживањем у стерилној води или коришћењем епрувета.

1. Мала количина гљивице однесе се у петљу за културу и утисне на површину агара у Петријевим посудама. Како се мождани удар продужава, споре су све више и више раздељене све док, као резултат, поједине колоније не настану из више или појединачних спора.

2. Спора инокуулума се поставља у епрувету са стерилном водом (10 мл), затим се одређена количина суспензије (на пример, 1 мл) преноси стерилном пипетом у епрувету са 9 мл стерилне воде. Свежа стерилна пипета употребљава се за мешање течности и преношење 1 мл у следећу епрувету која садржи 9 мл стерилне воде. Узгој се наставља по потреби. Такво разблажење од десет хиљада има неке предности у односу на ожичење. Коначно разблаживање, 1 мл спора суспензије је додато стопљеном агару, охлађено на око + 40 ° Ц..

3. Узмите пет епрувета одговарајућег агар медијума, истопите га и охладите на + 45 ° Ц. Затим се мала количина спора уноси у једну од епрувета - епрувета се помера између дланова и садржај се излива у Петријеву посуду. Празна епрувета поново се напуни из друге епрувете истопљеним медијумом, помиче се између руку и сипа у другу шољу. Овај поступак се понавља са остале три епрувете..

Приликом спровођења теоријског истраживања или анализе популације било ког географског облика, потребно је добити културу из једног спора. Готово моноспорна култура многих гљива добија се на следеће начине.

1. Слаба суспензија спора припрема се на стерилном стакленом тобогану у стерилној води потапањем калциниране навлажене петље у спорулативној култури. Ова суспензија споре прошарана је дуж линије у Петријевој посуди на врло танкој плочи са агарима која се припрема у кључалој води и чува на + 24 ° Ц. Ако се то обави у 16-17 сати, онда се следећег дана у 9-10 сати обично примети почетак клијања и спремност спора за изолацију..

Када радите са двогледом (стереоскопски микроскоп), Петријева посуда се помера дуж линије марке и бира се одговарајућа клица. Одговарајућа игла прави изрез хангара од око 2 мм око споре. Овај квадрат и подручје непосредно око њега провјеравају се под малим увећањем биолошког микроскопа како би се осигурало да постоји само једна спора.

Блок врапарског агара се затим преноси стерилном иглом испод двоглепа у плочи или епрувети са агарима.

2. Храњива подлога се сипа у танком слоју у стерилну Петријеву посуду, затим се узима епрувета са стерилном водом и додаје се мала количина спора тестне гљиве у њу и добро се тресе у води. Након тога 4-5 капи суспензије спора се узимају металном петљом и пребацују у стаклени тобоган. Под микроскопом се броји број спора у свакој капи. Ако се пад у просеку заврши н спора, стерилна вода се додаје у епрувету да би се повећала запремина у н+1 пут.

Штавише, можемо претпоставити да ће у једном паду бити просечно један спор. Након тога, 3-4 капи се узму из епрувете са разблаженом суспензијом спора и пренесу у Петријеве посуде на агар медијуму. Капи би требало да буду одвојене једна од друге на релативно великој удаљености. Под микроскопом проверите број спора које падају у сваку од ових капи. Гледање је са дна шоље, који је за то пажљиво окренут. У исто време, оне се бирају међу капљицама у којима се налази једна спора, а на чаши су означене воштаном оловком. Колоније добијене у Петријевим посудама прегледавају се у ободним епруветама од агара.

Понекад се кап капљице суспензије која садржи једну спору стави на стерилну чашу у Петријевој посуди и дода се комадић агар медијума - након што се мицелијум гљивице обрасте са њом, култура се пренесе у епрувету или Петријеву посуду.

3. Хансен (Х. Р. Хансен, 1926) користио је танке стаклене капиларе, спуштене суспензијом спора у топли агар медијум. Те капиларе су затим микроскопски прегледане и исечене на комаде, од којих је сваки садржавао по једну спору. Такви комади су затим подвргнути површинској стерилизацији и смештени у плочу са агарима.

Можете користити и друге методе добијања култура моноспора, које су наведене у литератури (на пример, метода "суве игле" Ханнах и других). Дакле, да би се из уредоспора добила монофос култура, хрђе житарица се отрежу на сувом стаклу. Затим се крај исцртане стаклене шипке одвоји једна спора испод двоглед или малим увећањем микроскопа. Крај штапа претходно се обрише памучном вуном навлаженом метилираним духом или алкохолом. Одабрана спора се у капљици воде преноси у лист биљке. Такве манипулације се изводе око 200 пута, имајући у виду да је стопа преживљавања обично 6-10.

Када се изолује моноподуљска култура гљивице, врши се прелиминарно размножавање популације хрђе, тако да се на лишћу формирају појединачни уредопустули. За то се користи мала количина спора за инокулацију..

Након што добију почетне пустуле као резултат моноспоре или монопускуларне културе гљиве, почињу множити споре у њима на одређеним сортама, понављајући процес репродукције биљака добро развијеним уретроподима 2-3 пута. Као резултат тога, акумулирана је довољна количина инокулума за каснији рад са њим.

Изолација чистих култура из различитих органа и ткива има своје карактеристике. При површном оштећењу плода, спољни оштећени слој се одстрањује, а мицелијум клија у влажној комори, након чега слиједи ресезија колоније на агарском медијуму. Претходно погођена површина темељно се испере стерилном водом..

Када се изолишу културе из унутрашњих делова фетуса, они се 5 минута темељно исперу, дезинфикују меркуровим хлоридом (1: 100) и поново оперу стерилном водом, а комадићи плода исечени из унутрашњих ткива стерилним скалпелом се ставе на хранљиви агар.

Када изолирате патогене који узрокују спољашње оштећење коријена, користите технику описану за плод. Са унутрашњим оштећењима, корени се темељито исперу, запале, а затим се направе попречни или уздужни пресеци. Тако добијени мали комади унутрашњег оболелог ткива клијају на медијуму за агар културу..

Изолација гљивица из лишћа, латица и других деликатних органа повезана је са познатим тешкоћама, јер се у овом случају готово мора напустити површинска стерилизација уз помоћ хемикалија које могу утицати на мицелијум патогена у мезофилу. Да бисте повећали тачност и поузданост селекцијског рада, требало би да користите најмање могуће дијелове ткива, истовремено повећавајући њихов укупни број.

Гљиве које инфицирају кору и дрво (трахеомикоза, трулеж, некроза) могу се изоловати директно из погођеног ткива стављањем површински стерилизованих комада или кришки на храњиве подлоге или од споре и мицелија добијене у влажној комори. Дрво и кора би требали бити свјежи, јер се гљивице из плијесни развијају у устајалим узорцима који зачепљују усјев..

Погођено дрво се дезинфикује неколико минута урањањем у 95% -тни алкохол или 0,5% -тни раствор калијум-перманганата, а потом пламеном. Затим се површински делови узорка сече стерилним скалпелом или микротомом, а плоче дебљине неколико микрона до 5-10 мм изрезују се изнутра и пребацују у хранљиви медијум.

Када се култура изолује из воћних тела хименомицета, површински слој се прво одсече, а мали комадићи пречника 4-5 мм се одсеку са унутрашње стране воћног носача и половину уроне у хранљиви агар. Затим се развијени мицелијум преноси у ободни агар.

Да би се изоловао ендогени мицелијум из младих садница, погођени делови се не стерилишу, већ само испирају, како се не би убили - материјал се благо пробавља и поставља на храњиви агар или у влажну комору - мицелијум који се појављује брзо се одваја, покушавајући да спречи раст сапрофитних микроорганизама.

Старије саднице се дезинфицирају у 0,5% раствору калијум перманганата, исперу водом и ставе у влажну комору одакле се развијени мицелијум преноси у хранљиви медијум. Такође је могуће користити одељке стабљике, који су положени на агар да клијају мицелијум патогених гљивица..

Микрофлора оболелих семенки се обично анализира након његовог развоја у култури на хранљивом медијуму (М. М. Самутсевицх, 1931). Да бисте то учинили, узима се укупни узорак из шарже семенки са разних места, одбројава се 200 семенки и 25 комада се стави у Петријеве посуде на агарском медијуму.

При одређивању површинске инфекције, семенке се не стерилишу; ради успостављања дубоке инфекције чувају се у калијум перманганату (0.5) 2-3 минута или се потапају у чисти алкохол током 1 минута.

У неким случајевима се очишћене семенке сече стерилним скалпелом на два дела. Јако мумифициране семенке се инкубирају на филтрираном папиру навлаженом стерилном водом, а након сушења и варења стављају се у Петријеве посуде. Како се појави споралација патогена, они се пребацују у ободни агар.

Када је изолована чиста култура, гљиве се превасходно узгајају на благо закисељеном агар медијуму или желатини (Н. А. Наумов, 1937). Током почетне изолације патогена, течни или јако навлажени медијуми не могу се користити, јер то доприноси развоју сапрофитних микроба. Такође не смете сејати патогене гљиве на чврсту хранљиву подлогу: пиринач, кромпир, хлеб и друге производе.

Да би се идентификовали патогени који у земљи постоје, у сврху накнадне изолације узимају се узорци карактеристичних разлика тла (подзол, чернозем, серозем итд.) На различитим дубинама од одређених култура итд. Приликом узорковања, део тла је затим стерилан. алат одваја жељени слој из кога се узима узорак од 10-20 г, стављајући га у стерилну посуду или омотницу. Препоручује се узимање тла са горњег стајања (до 3 цм) и дубље, на нивоу места главне масе корена. Да бисте у потпуности окарактерисали локацију, потребно је за три године прибавити информације о претходним усевима и киселости тла (пХ).

Када се проучава расподјела инфекције у пољу, јаме тла се ископавају на сваких 5 м на јединственом подручју; за извиђачке прегледе довољно је 5-10 јама тла по секцији..

Прикупљено тло се суши неколико дана до стања сувог на ваздуху у папирним омотницама, дроби се и поставља на храњиву подлогу агар помоћу стерилне лопатице, скалпела и другог алата. Сваки узорак (10–20 г) се подели у 6–7 Петријевих посуда, а затим се суђе чувају у термостату на температури 20–25 ° Ц и периодично се прегледавају. Како се развијају гљивичне колоније, они се у епруветама преносе у коси агар. Присутност изолованих гљивица одређује се конвенционалним методама. Након 7-8 дана од почетка раста колоније, чаше постају неприкладне за претрагу гљивица због загађења животне средине сапрофитним микроорганизмима.

Проучавање гљика-микромицета из земље могуће је изоловањем у чисту културу или коришћењем методе „обрађивања плоча“, микрокамерама тла, педоскопом од врло танког стакла и другим техникама.

Изолација микроорганизама, укључујући фитопатогене гљиве, у одрживом стању из воде и ваздуха је подручје специјалних истраживања. Постоје различите методе анализе користећи узорке, аутоматске волуметријске и инерцијалне споре (Ф. Грегори, 1964. - Иу. П. Боцхков, А. И. Воронова, В. Ф. Думски, 1966 - А. И. Клоцхко, 1969, итд. .).