Дијагностичке методе вирусних и вирусних болести биљака

Визуелна дијагностичка метода

У већини случајева није тешко утврдити вирусну природу болести. Обично га одређују спољни знакови, као што су линеарни хлоротични узорци или обрасци прстена на младим листовима. Међутим, њихова идентификација је често тешка, јер вируси имају асимптоматски (латентни) карактер развоја. Симптоми зависе од стања организма, агресивности соја патогена, услова околине и дужине времена боравка вируса или вируса у ћелијама домаћина. На пример, симптоми болести су јасно изражени код биљака које расту на јаком светлу и на умереној температури, при високој температури и при слабом осветљењу, симптоми болести се уопште не могу изразити..

Разјашњење вена најмлађих листова често је један од првих знакова системске вирусне инфекције. Вене постају жуте и прозирне. Касније лишће може бити мозаик, шарено или потпуно жуто (хлоротично)..

Период инкубације болести зависи од врсте вируса, биљке домаћина и услова животне средине, али у сваком случају је неколико дана или недеља.

Ако су први симптоми вирозе примећени на садницама, тада је извор заразе било у семену или је инфекција настала путем носача. Ако су заражене биљке смештене у култури потпуно случајно или само у редовима посађеним из исте серије, онда то указује да је биљни материјал највероватније заражен. Ако се болесне биљке нађу на одређеним пољима поља, а појава заражених подручја услед разлика између тла, постоји сваки разлог да претпоставимо ширење вируса кроз тло.

Такође треба напоменути да постоје симптоми карактеристични за вирозу, али проузроковани другим узроцима (лезије фитоплазме, неке бактерије и сису штеточине). Симптоми слични вирусној инфекцији често су узроковани поремећајима минералне исхране, попут оних повезаних са недостатком гвожђа (смоква 1) Разне деформације органа могу бити узроковане регулаторима раста и хербицидима различите природе (смоква 2).

Према томе, коришћењем методе визуелне дијагностике тачна идентификација спољним знаковима оштећења вирусима и вироидима је немогућа, јасан одговор може се добити само инструменталним методама (ензимски имуносорбент тест, ПЦР анализа, итд.).

Метода биљака индикатора

Метода биљака индикатора - То је врло уобичајена метода дијагностицирања вирусних и вирусних болести и идентификација њихових патогена. Метода биљних индикатора заснива се на употреби биљака индикатора, које у већини случајева дају јасне и специфичне симптоме карактеристичне за одређену врсту патогена. Биљке индикаторске биљке су заражене механичком инокулацијом соком, што резултира инфекцијом као локалном некрозом, дисколорацијом и инхибицијом раста..

За вирус парадајз аспермије користе се младе индикације биљака дувана као индикатор (Ницотиана глутиноса), за дијагнозу кромпира Кс-вируса - сферни амарант (Гомпхрена глобоса) Да би се открила инфекција рајчице вирусима, вретенасти гомољи кромпир гомоља користе скополију као показатеље (Сцополиа синенсис) или осетљиве сорте парадајза. У неким случајевима се за инфекцију могу користити појединачни изоловани листови биљака са индикаторима. Вируси толерантни на сокове се цепају на биљке индикаторе разним методама. У ретким случајевима за пренос вируса користе се инсекти и биљка паразита.

Серолошки дијагностичка метода

Метода се заснива на реакцији таложења (стварање талога) између специфичних антитела и протеина (антигена) патогена. Метода серолошке дијагнозе није применљива за идентификацију вироида због одсуства протеинске компоненте, као ни за велики број вируса који не подносе сокове са слабим имуногеним својствима. Следеће модификације серолошке дијагностике могу се користити за идентификацију вируса у биљци:

1) Ензимски имуносорбентни тест (ЕЛИСА) - најосетљивија метода која вам омогућава да добијете квантитативне процене. Заснива се на специфичном препознавању површинских антигена вируса антителом у присуству ензима. Ова метода се широко користи у пракси за идентификацију вируса усева, погодних за серијске анализе.

2) Дрип метод. Изводи се на следећи начин. На стакленом слајду капи биљног сока помеша се са капљицом антисерума. Након пар минута, реакција се процењује под микроскопом при малом увећању у тамном пољу или чак визуелно, без микроскопа.

3) Метода двоструке дифузије - изводи се у агар гелу ради одређивања сферних и других малих вируса. Изводи се овом методом, у неке јажице које су исечене у слој агарног медијума, додаје се антисерум, а у друге - пречишћени биљни сок. У гелу вирусне честице и антитела дифундирају једна на другу да би се састале, а на месту сусрета формирају различите таложне линије у случају њихове комплементарне специфичности.

4) Метода радијалне имунодифузије. Помоћу ове методе, антисерум се додаје директно у агарни медијум, а јажице се пуне биљним соком. Реакција је позитивна ако се таложници у облику прстена формирају око јажица..

5) Метода адсорпције. Метода се заснива на чињеници да пре реакције са антигеном, антитела везују неки инертни материјал на велике честице, на пример, латекс. Када реагира са антигеном, долази до јасно видљиве аглутинације целог комплекса..

Метода електронске микроскопије

На ултра танким пресецима оболелих биљних ткива, помоћу електронских микроскопа, можете одредити структуру, облик и чак величину вируса или вироида. Често се користи електронски микроскоп у комбинацији са серолошким методама (имуноелектронска микроскопија), а вирусне честице са слојевитим антителом могу се открити. Метода електронске микроскопије се користи изузетно ретко због високих трошкова опреме и реагенса, потешкоће у изолацији вируса и вироида, оксидације биљних делова и низа других фактора.

Метода електрофорезе

Ова метода заснива се на одвајању претходно пречишћених нуклеинских киселина вируса (вироида) или његових протеина у гелу под утицајем електричне струје, праћено бојењем зона. Метода електрофорезе омогућава вам одређивање масе и величине вирусних или вироидних структура. Метода се широко користи за визуелни преглед коначног производа ланчане реакције полимеразе. Да бисте забележили резултате, направите фотографије гела у препуној или рефлексној светлости.

Молекуларно биолошке методе заснивају се на познавању структуре молекула РНА (ДНА) вируса или вироида. Најчешћи тест је амплификација (умножавање) секвенце специфичних за врсту РНА током ланчане реакције полимеразе (ПЦР). Појединачни фрагменти РНА изоловани из испитиваних биљака који су специфични за само једну врсту или род вируса множе се ензимима у присуству прајмера (одговарајући олигонуклеотиди). Штавише, њихов број у коначном производу реакције милионима прелази почетни број примерака одабраног фрагмента РНА. Затим се вирусна РНА (ДНК) открива гел електрофорезом или имунофлуоресценцијом. Метода се широко користи у практичним виролошким студијама..

Метода ДНК сонде такође је заснована на принципу комплементарности нуклеинских киселина. Синтетизиране су специфичне сонде које хибридизирају само са специфичним нуклеотидним низовима вируса или вирусне РНА. У зависности од избора сонди, могуће је разликовати групе, врсте, па чак и сојеве вируса и вироида.

Метода инклузије

После развоја вируса, накупине вирусних честица (инклузије) назване Ивановски кристали, који су видљиви помоћу конвенционалног светлосног микроскопа, формирају се у биљним ћелијама. Сваки вирус има свој облик вирусних инклузија, који се формирају, најчешће, у ћелијама епидерме лишћа или у ћелијама длачица. На пример, вирус дуванског мозаика има хексагоналне и игличасте кристале - кромпир Кс вирус обично формира сферна аморфна тела. За откривање вируса краставца, листова кромпира и неких других зеленог пикантног мозаика користе се хемијске аналитичке дијагностичке методе..